文|小彭的灿烂笔记
编辑|小彭的灿烂笔记
前言
在过去的二十年中，对人类微生物组的研究迅速成为一个有吸引力的研究领域，旨在为复杂的生态系统提供新的见解，根据引用最多的定义，微生物组被描述为“身体空间或其他环境中的共生，共生和致病微生物群落”。
当代定义指出，术语微生物组，不仅指所涉及的微生物，而且还包括它们的“活动剧场”，包括形成一个动态和互动的微生态系统，容易在时间和规模上发生变化。
它还涉及整合到宏观生态系统中，包括真核宿主，益生菌已被确定为潜在有效的治疗剂，能够通过改变肠道生态系统的微生物组组成和功能来改善健康。
世界卫生组织和粮食及农业组织（WHO/FAO）将益生菌定义为“当以足够量施用时对宿主有益于健康的活微生物”，也促使大量研究工作来确定其作用机制，并最大限度地提高其功效。
影响益生菌有效性的基本方面之一，是施用细胞的活力和活性，益生菌细胞在通过胃肠道（GI）运输过程中的存活，对于发挥其预期的健康影响至关重要。
暴露于恶劣的胃部疾病、胆盐和酶活性等因素，会显著影响益生菌细胞的活力和功能，因此确保它们在整个胃肠道运输过程中的活力，成为开发有效益生菌配方的关键考虑因素。
细胞固定
细胞固定已成为增强益生菌细胞活力和活性的一种有前途的策略，该技术涉及活细胞在支持基质上的物理或化学粘附，提供保护性微环境。
保护细胞免受恶劣条件的影响，已经探索了用于固定益生菌细胞的各种载体，包括天然聚合物，凝胶，纤维和食品基质。
这些固定化方法具有多种优势，例如提高细胞稳定性，延长保质期，提高对环境胁迫的抵抗力，更快的发酵速度和降低微生物污染的风险。
尽管越来越多的研究专注于寻找新的益生菌菌株，但很少有研究，严格地将模拟胃肠道运输的体外测试，与更真实的体内模型进行比较。
相反的是大多数研究，通过应用分离的静态体外测定，来评估益生菌菌株的耐受性，这些测定不能充分复制体内遇到的顺序应激条件。
事实上由于益生菌与宿主胃肠道系统之间存在动态相互作用，因此使用体内模型（如小鼠模型）对于全面评估益生菌菌株的功效仍然至关重要。
选择材料和方法
先通过离心获得生长的鼠李糖乳杆菌OLXAL-4细胞，随后用无菌强度林格溶液冲洗，最后通过离心收获（湿自由细胞）。
对于细胞固定，将收集的细胞重悬于无菌的17/140强度林格氏溶液中，以达到初始培养体积（固定化溶液），作为固定载体，选择了四种天然载体，包括燕麦和小麦片以及苹果和香蕉碎片。
在固定过程之前，将燕麦和小麦片在30°C的烤箱中加热15分钟，而苹果和香蕉片则未经预处理，将燕麦和小麦片浸入固定化溶液4分钟。
在细胞固定过程中，天然支持物在室温下不受干扰，细胞固定完成后，过滤天然支持物，并用无菌度林格氏溶液冲洗，旨在去除任何非固定细胞（湿固定细胞）。
在天然载体上产生冻干固定细胞，为了进行比较，湿游离鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞也进行了24小时冷冻干燥过程。
静态消解仿真模型的示意图
模拟唾液相后，过滤培养物-SSF溶液，弃去液相，然后将10g固定化培养物加入到10mL模拟胃液（SGF）中，其中含有来自猪胃粘膜的2000U/mL胃蛋白酶（≥3200U/mg），并在37°C下孵育110分钟（模拟胃期）。
在孵育过程中，固定化培养-SGF溶液的pH值从4.9逐渐降至3.0，旨在更好地模拟食物从口腔向胃的过渡条件。
在模拟胃期之后，过滤培养液-SGF，弃去液相，然后将5g固定化培养物加入到5mL模拟肠液（SIF）溶液中，含有100U / mL猪胰粘蛋白（8×USP规格），并在37°C下孵育120分钟（模拟肠期）。
模拟肠相后，过滤固定化培养物-SSF溶液，弃去液相，收集固定化培养物，在所有三个模拟消化阶段中，每天新鲜制备酶溶液，并通过添加0.5 M HCl或1 M NaHCO来调节pH值3。
在加入SSF后和每个模拟消化阶段完成后，立即收集固定化鼠李糖乳杆菌OLXAL-1培养物的样品，在MRS琼脂上使用10倍连续稀释和倾倒板法，评估活的鼠李糖乳杆菌细胞计数，将MRS板在37°C厌氧孵育至少72小时，并确定存活率。
对所得结果进行分析
首先谷物（燕麦和小麦片）和水果（苹果和香蕉片）上的游离和固定的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞，以湿干和冻干形式产生。
随后确定活的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞计数，燕麦和小麦片上的湿固定培养物水平为9.08至9.19 log CFU/g，而苹果和香蕉片的相应水平>8 log CFU/g。
冷冻干燥后，燕麦和小麦片上的冻干固定细胞水平为>9 log CFU/g（干细胞质量）和>8 log CFU/g（湿细胞质量），而苹果和香蕉片中的相应水平为>8 log CFU/g（干细胞质量）和>7 log CFU/g（湿细胞质量）。
值得注意的是为了对宿主产生有益的健康影响，在天然载体上的所有固定化冻干细胞培养物中，都达到了每日最低推荐细胞浓度。
冷冻干燥前后谷物和果片上游离或固定化的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞的水平（log CFU/g）
当将湿游离或固定化的鼠李糖乳杆菌细胞的初始群体，与相应的再水化冻干培养物（湿细胞团）进行比较时，冷冻干燥导致细胞活力显着降低（p < 0.05）。
但在所有情况下，都确定了高水平的固定化细胞（>7 log CFU/g），尽管有了减少的趋势，但冷冻干燥过程仍然被认为是必要的。
因为它不仅在细胞水平上，提供了长期稳定性，而且在处理和加工过程中的整体产品安全性、质量和便利性，也同样具有优势。
在以前的研究中，已经记录了天然载体上高水平的干燥固定化乳酸菌（LAB），特别是细胞固定和冷冻干燥对三种不同乳酸菌株（植物乳杆菌B282，酸乳杆菌SK和植物乳杆菌F4）的影响。
冷冻干燥的固定化乳酸菌细胞在玉米片、开心果和葡萄干上的记录浓度为>7 log CFU/g，在室温下储存6天时保持在>40 log CFU/g。
有人还在苹果片上观察到高水平的冻干固定化鼠李糖乳杆菌细胞，水平超过9 log CFU/g。
随着微生物分析，通过扫描电子显微镜验证细胞固定化，有趣的是鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞表现出对食物基质的粘附，并形成聚集体，以前称为“细胞消光”。
电子显微照片显示（红色圆圈）苹果片（左）和燕麦片（右）上固定的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞
为了研究细胞固定化对鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞，在胃肠道转运过程中活力的潜在保护作用，对湿法和冻干固定化培养物，进行了静态体外消化模型。
为了进行比较，湿法和冻干游离鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞，也在同一消化过程中进行了测试。
模拟唾液期孵育，对湿干和冻干游离或固定化鼠李糖乳杆菌OLXAL-1培养物的活细胞计数没有影响，而在模拟胃期和肠期孵育，导致所有病例均显著减少（p <0.05）。
值得注意的是与游离细胞相比，体外模拟消化后所有固定化的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1培养物的存活率更高（p < 0.05）。
并且与相应的冻干培养物相比，在湿法中观察到游离细胞和固定细胞的存活率更高，这一结果可以用冷冻干燥过程中的细胞应激来解释。
此外统计分析显示了鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞的状态（湿或冻干）和性质（固定或游离）之间，关于其在体外消化期间存活的强烈相互作用。
固定化和游离鼠李糖乳杆菌OLXAL-1培养物对模拟消化阶段的耐受性
增强胃肠道中细菌细胞的存活和活力的策略
抵抗人类胃肠道的恶劣和降解条件，被认为是益生菌培养的必要先决条件，以赋予潜在的健康益处，这一要求对于乳酸菌株尤其重要。
因为它们通常以难以生存这种具有挑战性的条件为特征，已经提出了几种策略，来增强胃肠道中细菌细胞的存活和活力。
在这些策略中，一种值得注意的方法是细胞固定，它涉及物理或生化限制益生菌细胞，防止它们不受限制地运动，并为它们提供保护性基质或支撑结构。
特别是食品基质的天然载体上的细胞固定，具有明显的优势，这主要是因为它们具有食品级性质，可确保安全合规性，低成本和高可用性，并且它们易于在固定过程中进行处理。
一些研究报告了在体外暴露于低pH值、胆盐和消化酶后，将食物基质上的固定细胞与游离细胞进行比较时，具有保护作用。
例如，植物乳杆菌NCIMB 8826细胞被固定在断奶混合物（谷物 – 豆类混合物）食物基质上，然后暴露于两种单独的耐受测定：一种针对低pH值，另一种针对胆汁盐的存在。
在这两种情况下，杂草食物基质对植物乳杆菌细胞，具有保护作用，因为与体外消化后的游离细胞相比，固定化培养物中的存活率显着更高。
以同样的方式，大麦和麦芽纤维上的细胞固定，有助于暴露于模拟胃液和胆汁后乳酸细胞的稳定性，除了使用谷物作为固定支持外，还研究了各种水果对模拟胃肠道运输的潜在保护作用。
有人研究了干酪乳杆菌 CSL3 在猕猴桃、番石榴和菠萝片上的固定化，随后将其掺入小瑞士奶酪中，值得注意的是暴露于模拟胃肠道运输条件的固定细胞，或自由细胞的小瑞士奶酪，在细胞活力方面没有差异。
根据他们的说法，这一结果可以归因于食物基质（奶酪）中包含的成分有助于保存益生菌细菌。
根据上述研究，观察到的细胞固定对细菌细胞的保护作用，可归因于各种因素，摄入食物的缓冲能力是食物的缓冲能力，其会暂时增加胃液中的pH值，从而为益生菌提供保护屏障。
而谷物和水果中纤维和糖的存在，也被认为是促成剂，因为它们为LAB的生长和存活提供了最佳底物。
在燕麦片上施用冻干游离或固定化的鼠李糖乳杆菌OLXAL-0细胞之前和之后 c小鼠粪便中乳酸杆菌的水平
还表明细胞附着在食物基质上，或将它们困在其中，起到屏障作用，降低益生菌在胃肠道转运过程中，对不利条件的易感性，
然而为了验证从体外研究中，获得的这些观察到的保护作用，必须在动态体内模型中，进一步研究细胞固定对食物基质的有效性。
接受对照饮食的动物，OD：接受对照日粮的动物，每日剂量补充2克冻干燕麦片
特异性引物
基于鼠李糖乳杆菌组的物种特异性引物，通过靶向mutL位点，并使用鼠李糖乳杆菌GG作为参考菌株，确认了鼠李糖乳杆菌细胞的存在。
801 bp的PCR产物证实，在实验方案的第6天，仅在ID组和FD组的小鼠粪便中存在水平为>10log CFU/g的鼠李糖乳杆菌细胞，也进一步说明了施用细胞的存活。
先前使用体内BALB / c小鼠模型，评估胃肠道转运后，乳酸菌细胞活力的研究已经报告了关于小鼠粪便中，乳酸杆菌计数增加的类似结果。
每天口服7天后（1×109CFU每天）与基线相比，LAB的数量显着增加，在所有情况下均达到7 log CFU / g小鼠粪便>普通水平。
结语
在胃肠道转运过程中，我们探究了细胞固定在谷物和水果上，作为鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞的递送载体的有效性，值得注意的是，在体外消化后，所有固定化的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1培养物的存活率均高于游离细胞。
燕麦片上固定化细胞的存活率最高（84.76%），在将冻干游离和固定化的鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞施用于BALB / c小鼠（组ID和FD）时，与基线相比，小鼠粪便中，观察到乳酸杆菌群显着增加。
重要的是ID组的乳酸杆菌计数明显高于FD组（分别为8.02 log CFU/g和7.64 log CFU/g），并且使用多重PCR分析。
在小鼠粪便（组ID和FD）中确认存在超过6log CFU / g水平的鼠李糖乳杆菌细胞，这些发现强调了固定化鼠李糖乳杆菌OLXAL-1细胞的成功存活，并表明了该方法在益生菌行业中的应用潜力。
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